Klinická genetika

KLINICKÁ GENETIKA


1. VÝZNAM LEKÁRSKEJ GENETIKY:
- v súčasnosti stúpa
- základný predpoklad úspešnej prevencie a liečby chronických chorôb u detí, znižovanie dojčeneckej a detskej úmrtnosti, prenatálnej dg. a zlepšenia starostlivosti o zdravý telesný i duševný vývoj v prekoncepčnom, prenatálnom i poostnatálnom období
- základný princíp na predlženie aktívneho veku a prevencie zdĺhavých degeneratívnych ochorení v dospelosti ( kardiovaskulárne choroby, hypertenzia, arterioskleróza, cukrovka..)
- pozitívne ovplyvňovanie spoločenského vývoja ( uplatnenie gen. poznatkov v starostlivosti o zdravý telesný a duševný vývin jedinca, t.j. úspešná voľba povolania- osobné šťastie – naplnenie záujmov spoločnosti.
-
2. VÝSKYT GENETICKÝCH CHOROB:
- v súčasnosti – stúpajúca tendencia – 4-6 % v populácii narodených detí
- –10,5% u detí a dospelých
- – 35-65% u duševne chorých
- podiel na natalite: – 25% potratovosť
- – 25-35% dojčenecká úmrtnosť
- –60% úmrtnosť do 30. roku života
- GCH zaberajú: 30-48% z lôžkového fondu detí
- 10% z lôžkového fondu dospelých
- tendencia súčasnosti: všetky med. Odbory využívajú LG na liečebno-preventívne a diagnostické účely, klesá natalita, stúpa priemerný aktívny vek-využitie genetiky
- molekulová technika -najvýznamnejšia oblasť LG –preventívna medicína, prenatálna dg.
- dôležité: poznať podstatu, možnosti a hranice LG v súvislosti s individuálnou starostlivosťou o rodinu aj so zdravotníckou politikou spoločnosti
- vývoj: neustále postupuje – budúcnosť – dokonalejšie metódy LG. Kompletné zmapovanie ľudského genómu, dokonalejšie preskúmanie náchylnosti a vnímavosti na choroby a zdokonalenie prevencie.


3. KTO, ČO OBJAVIL V ROKU 1986, 1902, 1909












4. KTO? ČO OBJAVIL V ROKU 1950, 1953, 1956
1950.– TSIO, LEVAN – objavenie chromozómov (omylom v hypononickom prostredí ( namiesto fixačného roztoku pridali do preparátu vodu, chromozómy sa roztiahli a boli viditeľné)
1953 – WATSON, CRICK objavili štruktúru DNA
1956 – DEAJEN opísal prvú chromozómovú chorobu – začiatok klinickej
cytogenetiky

5. VYŠETROVNIE X CHROMATÍNU Z BUKÁLNYCH STEROV:
K 5.,6. 7. – sexchromatín sa vyšetruje nepriamymi cytogenetickými metódami, na orientačné určenie počtu chromozómov v bunke, na vyhľadanie ľudí s poruchou pohlavných chromozómov, na rozlíšenie X,Z chromatínu aj v somatických bunkách v interfáze.
Z BUKÁLNYCH STEROV X-chromatín:
- vypláchnutie úst, ster z bukálnej sliznice lacentkou – bez poranenia!
- nanesenie na podložné sklíčko, roztrieť ako krvný náter
- po vyschnutí pridať kvapku jadrového farbiva (acetorceín, lactacetorceín)
- priložiť krycím sklíčkom –jadrá sa oploštia-a použiť filtračný papier na odsatie prebytočného farbiva
- VYHODNOTENIE: po 1 min. svetelným mikroskopom: vidieť planokonvexné telieska na okraji jadra ( Barrov znak) , ak sú prítomné vo viac ako 10% - pozitívny nález.


6. VYÉTRENIE X CHROMATÍNU Z KRVNÝCH NÁTEROV
:
-farbenie panopticky podľa G.Romanowského
-na jadrách segmentovaných granulocytov hľadáme zvláštne paličkovité výbežky jadra ( drumstick) ak je ich viac ako 1 % -nález je pozitívny



7. VYŠETRENIE Y CHROMATÍNU
:
- fluorescenčnou metódou klinickej cytogenetiky, po farbení derivátmi chinakrínu, ktorý sa viaže len k heterochromatínu , chromatínY žiari najintenzívnejšie, je viditeľný aj v kľudovej , nedeliacej sa fáze ako žiariací bod – F teliesko – svetielkujúca bodkav okrúhle bunke lymfocytu periférnej krvi alebo v oválnej bunke sliznice.


8. VÝZNAM A HODNOTENIE CYTOGENETICKÉHO SKRÍNINGU


- vyhľadávanie rizikových osôb v populácii, u ktorých hrozí vznik choroby aj dedičnej
- cieľ: prediktívna medicína
Význam: - včasná liečba
- poradenstvo ( konzultácie)
- ďalší rozvoj starostlivosti o zdravie obyvateľstva
Zameranie budúceho vývoja CG: perinatológia, výživa, pracovné lekárstvo, starnutie.


9. SPOSOBY VYŠETROVANIA CHROMOZÓMOV:
Vyšetrenie chromozómov: základné vyš. Klinickej cytogenetiky
Podstata: získanie dostatočného počtu mitotických buniek v metafáze delenia – chromozómy sú vtedy vhodne priestorovo rozložené a preto viditeľné
Spôsoby vyšetrovania: - nepriame metódy ( bežné) – kultivácia rôznych buniek ľahko
dostupných tkanív in vitro
- priame metódy ( výnimočne)-z buniek neoplastických, kostnej drene
- prax: krátkodobá kultivácia lymfocytov periérnej krvi a to –
mikrometódou ( deti, dojčatá)
makrometódou ( dospelí)
Blastická transformácia sa dosiahne pridaním fytohomaglitínu do kultivačnej
pôdy



10. NOMENKLATÚRA CHROMOZÓMOV, ZOSTAVOVANIE KARYOTYPU,
IDIOGRAM
Nomenklatúra- parížska r 1971? (81)
- podľa pásikov na ramenách chrom.
- Podľa regiónov na chromozómoch
Zostavovanie karyotypu: získanie dostatočného počtu mitotických buniek v metafáze, kedy je vidieť centroméry chromozómov v kultivovanom sére hlavne z leukocytov – monocytov, ktoré sa blasticky transformujú a delia pomocou fytohemaglutínu, viditeľné a roztiahnuté chromozómy sa potom po vyschnutí rozstrohajú, zoradia a odfotia.
Idiogram je vlastne vzorec jednej osoby, zostavujú sa rovnaké karyotypy.


11. MIKROMETÓDA NA VYŠETRENIE CHROMOZÓMOV.
1. odber krvi : po očisteni bruška prsta éterom bodnutím sterilnej ihly odoberieme4 – 6 kvapiek krvi, do pripraveného kultivačného média.
2. kultivácia v termostate pri 37°C 72 hodín, 2x denne premiešame vírivým pohybom
3. blokáda rastu buniek Colcemidom, kolcichín zastaví poruší funkcie vretienka a zastaví delenie buniek ,blokuje mitózu v metafáze, tým v kultúre narastá počet mitotických buniek, dávame ho 6h pred skončením kultivácie.
4. hypotonácia redestilovanou vodou(opatrne po stenách skúmavky, aby sa monocyty nezničili, erytrocyty to nevydržia),inkubujeme v termostate 20min.
5. fixácia tizian roztokom – metanolom, centrifugujeme pri 500-800 otáčkach. Odsajeme supernatant, znovu fixácia, centrifugácia, odsatie, fixácia, centrifugácia
6. zhotovenie preparátov, k sedimentu pridáme 1-2- kvapkz fixašnej zmesi, naniesť na podložné sklíčko, rozfúkneme, pretiahneme nad plameňom pre lepšie priestorové rozloženie chrom.pripravíme 3-5 preparátov.
7. farbenie konvenčnou metódou alebo diferenčné
8. hodnotenie pod svetelným mikroskopom

12. MAKROMETÓDA NA VYŠETRENIE CHROMOZÓMOV:

Spôsob odberu krvi: do heparizovanej striekačky nalačno 5-8 ml venóznej krvi,
ľahko namiešame, prenesieme do skúmavky s 0,2 phytohaemaglutinu, uzavrieť, nechať stáť pri izbovej teplote 30-50 min., aby sa krvinky usadili, sedimentáciu môžeme urýchliť centrifugáciou pri 200-500 ot./min.. z rozhrania plazmy a krviniek odoberieme pipetou najmenej 1 ml( je tam najviac leukocytov) praimo do pripraveného kultivačného média a pokračujeme ako pri makrometóde od bodu 2.


13. METÓDY NA FARBENIE CHROMOZÓMOV, KONVENČNÉ METÓDY

Ľahko sa pomocou konvenčných metód diagnostikujú vštetky numerické anomálie chromozómov.







14. DIFERENČNÉ METÓDY NA FARBENIE CHROM:
Na detekciu niektorých štrukturálnych aberácií
Od r. 1970 sa vyvinulo viacero metód, zvýšila sa identifikácia aj tých najjemnejších zmien
G – metóda : najrozšírenejšia
- zhotovené preparáty sa vystavia účinkom trypsínu, ktorý denaturuje
bielkoviny chrom., farbenie Giemsovým farbivom – diferencované– .
vychytávanie páskovanie- striedanie svetlejších a tmavších prúžkov na
chrom.
R – metóda :podobná G, ale najprv sa chrom. Vystavia teplu a potom sa farbia
Giemsovým farbivom - - páskovanie v opačnom poradí ako pri G
Q – metóda : chromozómy farbíme chinakrínom (fluorescenčné látky) pozorujeme
Pod fluorescenčným mikroskopom – svietiace a tmavé prúžky-
Svietiace zodpovedajú tmavým prúžkom pri G metóde
C – metóda – špecifické farbenie centromérovej oblasti a ďalších
heterochromatínových úsekov – miest so sekundárnou
konstrikciou chromozómov 1, 9, 16, a dlhých ramien Y chromoz.


15. FARBENIE SESTERSKÝCH CHROMATÍNOV

Podstata: zmena farbiteľnosti chromatínov po pridaní BUdr (bromdeoxyuridín)
Do kultúry buniek 24 h pred fixáciou – pri dvojnásobnej replikácii sa BUdr inkorporuje do novosyntetizovanej DNK namiesto tymínu a mení farbiteľnosť chromatínu – fluoresc. Farbivo ( akridín – orange ) farbí tie chromatidy, v ktorých BUdr substituuje iba jeden reťazec – dvojfarebné znázornenie chromatídov na tom istom chromozóme – svetlejšie a tmavšie vlákno DNK
Využitie: sledovanie výmeny sesterských chromatidov (SCE) , častej pri hereditárnych chorobách s chromozómovou instabilitou ( Bloomov syndróm, Fankoniho anémia)


16. VÝZNAM FARBENIA CHROMOZÓMOV PRE CYTOGENETICKÚ
DIAGNOSTIKU










17. DERMATOGLYFIKA, POJEM, METODIKA
Štúdium ohybových a papilárnych rýh na plôškach rúk a nôh
Rozšírená pre svoju jednoduchosť a veľký počet znázorniteľných nemenných znakov
Využíva sa v diagnostike niektorých dobre definovateľných syndrómov alebo chorôb- chromozómových aberácii, psychiatria, dermatológia –pri určovaní zygoty dvojčiat
Daktyloskopia - štúdium kožných rýh na prstoch

Typy kresieb na dlaniach a chodidlách:
- jemné papilárne línie ( rozmanité obrazce), nemenia sa po celý život
- súvisia s hmatom, zakladajú sa v 2. – 3. mesiaci vnútromaternicového vývoja, ich počet a tvar je konštantný ,rastom sa mení len dimenzia
- vytvárajú dvojaké dermatoglyfické obrazce : hlavné : oblúk, slučka, závit
vedľajšie : triradius, delta
- hrubšie ohybové ( flekčné) kožné ryhy: palcová, hlavná, trojprstá, axiálna

- Metodika: na dobre umyté ruky ( nohy ) nanesieme tlačiarenskú čerň z razítkovej podušky potretej valčekom čiernou pastou, na čistý biely papir robíme odtlačky celej ruky ( nohy) a každého prsta zvlášť

- Hodnotenie: kvalitatívne – tvar, dĺžka, stanovenie typu kresieb
Kvantitatívne – spočítanie počtu línii. –