histologia

Metódy zalievania v histológii
1.Princíp zalievania do parafínu a použitie

Princípom zalievania tkanív do parafínu je v presýtení odvodneného tkaniva parafínom. Parafín zahrievame na teplotu 56-58 ˚C. Parafín zaplní všetky mikroskopické štrbiny v tkanivách, takže potom môžeme tkanivo rezať, hrubé len na niekoľko tisícin mm. Je najpoužívanejšia metóda.
Parafín ma výhody

Ľahká metóda, rýchla, lacná
Parafín ma nevýhody

Zvraštenie tkaniva, nie je vhodný na zalievanie tuhých tkanív ( šľacha, chrupka, kosť... ), nemôžeme zalievať tkanivá ktorých máme dokázať lipidy
Zalievanie do parafínu sa skladá zo 4 etáp

1. odvodnenie tkaniva
2. presýtenie tkaniva tekutinou rozpúšťajúcou parafín
3. presýtenie tkaniva parafínom
4. vlastné zaliatie
2. Odvodnenie tkaniva

Tkanivá sa odvodňujú v stúpajúcom rade etanolov ( čiže zo stúpajúcou koncentráciou etanolu ). Robíme to preto, aby sme predišli zvrašteniu tkaniva, ku ktorému by došlo, keby sme tkanivo dali priamo do koncentrovaného etanolu.
Začíname koncentráciou – 70 %, 80 %, 96 %, 100 %
Prehľad odvodnenia

Alkohol Bloček<0,5 cm&#179; Bloček do 1cm&#179; Bloček>1cm&#179;
70 % 2 h. 2 h. 4 h.
80 % 2 h. 4 h. 6 h.
96 % 6 h. 6 h. 6 h.
100 % I. 1 h. 2 h. 4 h.
100 % II. 1 h. 2 h. 4 h.
100 % III. 1 h. 2 h. 4 h.
Čas potrebný na odvodnenie bločkov

Závisí aj od koncentrácie etanolu ( 70%, 80%, 96%, 100% )
Poznámka: na menšie bločky stačí kratší čas, väčšie bločky sa musia odvodňovať dlhšie.Musíme si pamätať, že ak je tkanivo príliš dlho v bezvodovom stave ( 100 % etanole ), tkanivo je príliš tvrdé.Bločky nesmú ležať na dne nádoby, podložíme ho vatou alebo zavesíme v gázovom vrecku.
Etanol

Dodávaný do laboratória je 96-98 % a riedime ho destilovanou vodou.
Používame - obyčajný etanol, bezvodný etanol
3. Presýtenie tkaniva látkou rozpúšťajúcou

Parafín

Po odvodnení treba etanol dôkladne odstrániť z tkaniva, lebo parafín sa v ňom nerozpúšťa. Preto sa tkanivo presycuje takou látkou, ktorá dobre rozpúšťa parafín, ale súčastne sa zlučuje s etanolom.
Ak zostane etanol v tkanive, alebo pri odvodnení voda, tkanivo pri presycovaní parafínom v termostate stvrdne a potom sa zle reže.
Látky, rozpúšťajúce parafín, ktoré používame na presýtenie excízie pri zalievaní do parafínu, môžeme rozdeliť na dve skupiny:

a) látky s nižším bodom varu, ktoré pri presycovaní objektu parafínom vyprchajú. Z tejto skupiny najčastejšie používame benzén a xylén.
b) Látky s vyšším bodom varu, ktoré nevyprchávajú, ale sa pri presycovaní tkaniva zriedia parafínom a ich zvyšok, ktorý zostal v excízii, nie je na závade pri rezaní.

Z tejto skupiny najčastejšie používame metylbenzoát, metylsalicylát a cédrový olej.
Pri použití benzénu

Nechávame excíziu ležať na dne nádoby. Aby bol z excízie úplne odstránený alkohol, čo je podmienkou pre dokonalé presýtenie parafínom, benzén tri razy vymeníme. Pritom ako prvý a druhý benzén môžeme použiť už raz i viac ráz použitý, ale tretí má byť vždy čerstvý. Priemerne veľké excízie necháme ležať v každom z troch benzénov aspoň 15 minút, väčšie i dlhšie.

Pri použití metylbenzoátu, alebo metylsalicylátu: presycujeme excízie v troch kúpeľoch, v každom aspoň 6 hodín. Keď nie sú tieto látky znečistené alkoholom, tkanivo sa nepoškodzuje ani po viacdňovom pobyte v nich.
Pri použití cédrového oleja

Sa tkanivo trocha menej zvrašťuje ako pri použití predchádzajúcich látok. Excízia po vložení do cédrového oleja najprv viac hodín pláva ( musíme ju preto prikryť v oleji namočenou gázou, aby sa pritom nevysušila ), a až keď sa presýti olejom klesne na dno nádoby.
Často sa používa spôsob zalievania, pri ktorom presýtime excízie najprv metylbenzoátom alebo metylsalicylátom, potom ešte benzénom.
4. Presycovanie tkaniva parafínom

Po presýtení tkaniva benzénom prenášame bloček do tekutého parafínu a to buď priamo alebo opatrným zalievaním cez benzén-parafín.
Benzén-parafínom sa presycuje tkanivo asi &#189; hodinu v zatvorenej nádobke pri teplote 40&#186;C. A potom sa tkanivo prenesie do čistého parafínu.
Pri bežnom zalievaní prenesieme benzénom presýtene tkanivo priamo do parafínu v termostate na 56-58&#186;C. Parafínom sa presycuje tkanivo v otvorených nádobách, a to postupne troma kúpeľmi čistého parafínu, aby sme tkanivo dokonale odstránili benzén.

1. kúpeľ: 2-4 hodiny,2. kúpeľ: 4-5 hodín,3. kúpeľ: 8-12 hodín
Poznámka: teplota kúpeľa nesmie byť vyššia ako 58&#186;C.

Tkanivo stvrdne, zvrašti sa, zle sa reže, zle sa farbí,
Používame dva druhy parafínov

Mäkké parafíny – s bodom topenia 50&#186;C
Tvrdé parafíny – s bodom topenia 55&#186;C

Parafín na zalievanie musí mať vhodnú štruktúru a nesmie obsahovať plynné produkty. Taký parafín je biely, drobivý, ľahko kryštalizuje a zle sa reže.
Preto nemôžeme tkanivo zalievať priamo do parafínu dodaného z obchodu, ale musíme ho skvalitniť.
Pozor: počas zahrievania uniká z parafínu štiplavý dym, a preto ho treba prepaľovať na dobre vetranom mieste, alebo v digestore!
Parafín nikdy nehasíme vodou – parafín vybuchne a začne horieť ešte viac!!!
5. Vlastné zalievanie

Po presýtení parafínom urobíme vlastne zaliatia. Keď boli excízie zabalené v gázovom vrecku, musíme ich z neho opatrne vybrať bez toho, že by sme sa dotkli prstami, a vložíme ich do nádobky s parafínom označenej číslom príslušnej excízie.
Na zalievanie sa používa skvalitnený a prefiltrovaný parafín, nikdy nie taký, ktorý sa predtým použil na presycovanie tkaniva.
Zalievame v komôrke, ktorú si môžeme urobiť z papiera alebo z kovu.
Najviac sa používajú kovové s posuvnými stenami, do ktorých môžeme prispôsobiť veľkosť tkanivových bločkov.Najviac sa používajú komôrky plastickej látky pre pracovisko s rutinnou histologickou prevádzkou.
Postup zalievania

Na kovovú podložku si položíme dve L formičky, do ktorých nalejeme 56-58&#186;C roztopený parafín, vložíme presýtenú excíziu, na L formičky položíme bloček, ktorý je označený číslom ako excízie v gáze a dolejeme parafín, bločky dáme stuhnúť do chladničky, bločky režeme na prístroji sánkový mikrotóm, na menšie časti
Najčastejšie chyby pri zalievaní parafínom

Parafínový bloček je belavý a drobivý ( bol zaliaty do čerstvého a neprehriateho parafínu ), bloček je belavý a mäkký ( v parafíne zostal benzén ), bloček je v strede belavý a suchý ( zle odvodnené tkanivo ), v strede bločku je preliačenina siahajúca až ku tkanivu
Vo všetkých prípadoch sa musí bloček v termostate rozpustiť a tkanivo znova zaliať!